Jun 04, 2023
IgG1 の柔軟性に対する Fc コアのフコシル化と軽鎖アイソタイプの影響
Communications Biology volume 6、記事番号: 237 (2023) この記事を引用 847 アクセス 3 Altmetric Metrics の詳細 N-グリコシル化は、モノクローナル抗体の生物活性の調節において重要な役割を果たします。
Communications Biology volume 6、記事番号: 237 (2023) この記事を引用
847 アクセス
3 オルトメトリック
メトリクスの詳細
N-グリコシル化はモノクローナル抗体 (mAb) の生物活性の調節に重要な役割を果たしており、軽鎖 (LC) アイソタイプもその物理化学的特性に影響を与える可能性があります。 しかし、これらの生体分子は非常に柔軟性が高いため、mAb の立体構造挙動に対するそのような特徴の影響を調査することは大きな課題です。 この研究では、加速分子動力学 (aMD) によって、κ LC および λ LC 抗体の代表である 2 つの市販の免疫グロブリン G1 (IgG1) の立体構造挙動を、フコシル化型とアフコシル化型の両方で調査します。 我々の結果は、安定な立体構造の同定を通じて、フコシル化とLCアイソタイプの組み合わせがヒンジの挙動、Fc立体構造、糖鎖の位置、つまりFcγRへの結合に影響を与える可能性のあるすべての要因をどのように調節するかを示しています。 この研究はまた、mAb の立体構造探索における技術の向上を表しており、aMD が実験結果を明らかにするための適切なアプローチとなっています。
臨床的に利用可能なモノクローナル抗体 (mAb) のほとんどは免疫グロブリン G1 (IgG1)1 です。これは、他の IgG サブクラスと比べて安定性が高く、強力なエフェクター機能があるためです。 mAb は 3 つのドメインで構成されます。2 つのフラグメント抗原結合ドメイン (Fab) と 1 つの結晶化可能フラグメント (Fc) で、重鎖と軽鎖 (それぞれ HC と LC) が含まれ、両方とも可変領域と定常領域を含みます。 可変ドメインは、適応免疫応答、または市販の mAb の場合は標的抗原への選択的結合を担当します。 抗体は、LC の 2 つの異なるアイソタイプ、つまり κ と λ2 を提示できます。 κ LC または λ LC を含む抗体の比率は種によって大きく異なり 3、約 100 種類の承認された治療用 mAb を考慮すると、λ LC4 を含む抗体はほんのわずかです。 これら 2 つのアイソタイプ間の機能的および構造的比較に関する研究はほとんど発表されておらず、Fab ドメインの協同性と柔軟性 5、および相補性決定領域 (CDR) の構造特性の違いが示唆されています 6。 Fc と特定の Fcγ 受容体 (FcγR) との相互作用によって免疫系を活性化する IgG1 の能力は、Fc7、8 の保存された Asn297 上の N-グリコシル化によっても制御される重要な側面と考えられています。 グリカンの長さ、組成、電荷の変化は、Fc ドメインの構造的完全性と立体構造に影響を与える可能性があり、その結果、FcγR への結合親和性が変化し、免疫応答に影響を及ぼします 9,10。 特に、コアのフコシル化は、FcγRIIIa (低親和性活性化受容体) に対する IgG1 の結合親和性を低下させるため、抗体依存性細胞傷害 (ADCC) に影響を与える可能性があります 1,11,12,13,14,15,16。 17.
これらの観察にもかかわらず、抗原認識とエフェクター機能活性化の両方の観点から、これらの生体分子の機能的挙動の調節における LC の違いの構造的役割はこれまで研究されていませんでした。 いくつかの研究 18,19 は、エフェクター機能に対するフコシル化の影響を説明する仮説を提案していますが、ヒンジおよび Fab ドメインの役割を考慮せずに Fc のみに焦点を当てています。 我々の以前の研究 20 では、フコースの存在が mAb 全体の立体構造挙動を調節し、原則として受容体結合にはあまり適さない T 字型立体構造の選択を誘導する可能性があることを提案しました。 私たちの以前の結果と一致して、Spiteri et al。 らは、グリコシル化 IgG1 と非グリコシル化 IgG1 の比較により、グリカンがどのように構造的制約を導入するかを実証しました。 この研究は、グリカンの除去がタンパク質の柔軟性を調節し、抗体が異なる立体構造空間を探索できるようにし、FcγRs21 への結合に影響を与えることにより、Fab-Fc 分離に影響を与えることを示しています。 この研究では、古典的分子動力学シミュレーションと加速分子動力学シミュレーション (それぞれ cMD と aMD) の組み合わせに基づく、mAbs に対する革新的なインシリコ アプローチを使用して、IgG1 の構造挙動におけるフコースと 2 つの LC アイソタイプの役割を調査します。 ）。 κ LC および λ LC 抗体の優れたモデルである 2 つの市販 IgG1 であるアダリムマブとアベルマブのアフコシル化 (G0) 型とフコシル化 (G0F) 型の比較が行われ、κ LC および λ LC 抗体の動態の調節における λ LC の重要な役割が示唆されました。 IgG1。 私たちの知る限り、標準サンプリング MD メソッドと拡張サンプリング MD メソッドの組み合わせは、mAbs の立体構造挙動の文脈で使用されたことはありません。 したがって、我々の結果は、抗体の柔軟性の研究における新しい将来の展望（実験的および計算的）への道を開く可能性があります。
90° for both Fab), as shown in Fig. 2. On the opposite, both G0 and G0F avelumab are prone to reach a T-shaped conformation, with θ > 90° in at least one Fab in G0 avelumab, and in both Fab domains in G0F avelumab. According to this analysis, the role of fucose in promoting the T-shaped conformation is confirmed for both isotypes. On the other hand, a putative role of the λ LC in promoting a T-shaped conformation, even in the absence of fucose, is figured out. Moreover, especially for avelumab, these results clearly spotlight the limit of cMD methods in exploring large conformational spaces of such flexible proteins. At the same time, aMD opens to the identification of other descriptors that allows a thorough investigation of the conformational behavior. Starting from these results, since the scope of aMD simulations was to identify minimum energy structures, the following analyses were focused on the frames and the corresponding conformations included in the identified energy minimum./p> 90° for both Fab domains, and we took into account also the conformational variability expected from MD simulations. The distance between the CH2 domains was measured between the glycosylated Asn using MDTraj38. Then, box plots were produced to evaluate the statistical significance of the observed values in the total 21,000 frames. For the aMD, a reweighing procedure was applied according to methods described by Miao et al.40 using Maclaurin expansion to the 10th order to approximate the free energy surface of the system as a function of θ angles. The RMSD matrices for the cluster analysis (of both cMD and aMD) were generated with CPPTRAJ41, while the clusters were obtained using a customized script based on the GROMOS algorithm42. In the case of antibodies C-alpha atoms were considered for the analysis, while for glycans the oxygens involved in glycosidic bonds. RMSD-threshold of 7.5 Å and 6.5 Å were used for the antibodies in cMD and aMD, respectively, and the maximum number of clusters was set to 15 and 10, respectively. For glycans clustering the RMSD-threshold was set to 1 Å and the maximum number of clusters to 10. The essential dynamics (ED) was computed on the overall trajectories by the covariance analysis tool of GROMACS 2020.120,43. Then, the resulting trajectories, projected along the first and the second eigenvectors, were filtered by the frames included in the energy minimum that was identified from the FES (computed as function of θ angles) and were used to calculate the Δϕ distribution. The minimum distance between glycan chains was computed by CPPTRAJ41 and the “nativecontacts” tool with the “mindist” option, while the distance between the center of mass of each chain and itself was computed with the “distance” tool. For the latter, the trajectories were pre-aligned on the Fc. The contacts between LCs and the hinge region were computed by CPPTRAJ41 with the “nativecontacts” tool, considering heavy atoms and a threshold distance of 4 Å. The hydrogen bonds (H-bonds) analysis was computed by a customized python script based on the MDTraj H-bonds identification tool20./p>3.0.CO;2-M" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-3773%2819990115%2938%3A1%2F2%3C236%3A%3AAID-ANIE236%3E3.0.CO%3B2-M" aria-label="Article reference 42" data-doi="10.1002/(SICI)1521-3773(19990115)38:1/23.0.CO;2-M"Article CAS Google Scholar /p>
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